В траве сидел кузнечик, или почему эти прямокрылые...
В траве сидел кузнечик, или почему эти прямокрылые зеленые?
29 мая 2025, 06:09
Разнообразие цветов насекомых впечатляло людей тысячелетиями, однако изучить его биохимию стало возможно лишь теперь. Певчий кузнечик Tettigonia cantans, знакомый нам своим стрекотанием теплыми летними вечерами, обладает зеленой камуфляжной окраской, помогающей скрываться в растительности. Во время летней практики на Звенигородской биостанции МГУ со студентами первого курса исследователям удалось обнаружить уникальный зеленый белок, обеспечивающий окраску кузнечика. В ходе исследования, опубликованного в журнале PNAS, коллективу ученых ФИЦ Биотехнологии РАН, ИБХ РАН и Биологического факультета МГУ им. Ломоносова удалось определить аминокислотную последовательность, решить структуру и описать хромофорную систему этого белка. Оказалось, что зеленый цвет обусловлен присутствием сразу двух хромофоров: синего билина и желтого ксантофилла, связанных внутри гидрофобной полости. Исследователи также обратили внимание на зеленую окраску других насекомых и пауков и обнаружили, что у некоторых из них она также обусловлена похожими дихромофорными белками, а у других — отдельными белками. Таким образом, зеленая маскировочная окраска многократно и независимо возникала в разных линиях наземных членистоногих. Крылышкуя золотописьмом Тончайших жил, Кузнечик в кузов пуза уложил Прибрежных много трав и вер.Велимир Хлебников Механизмы формирования цвета насекомых разнообразны и основаны на различных физических принципах. Так, металлический блеск надкрылий некоторых жуков [1], неоновые цвета крыльев бабочек и пчел [2] обусловлены структурной окраской [3] — интерференцией света на упорядоченных структурах хитинового экзоскелета. Яркая зеленая хемилюминесценция сегментов брюшка светлячков становится возможной благодаря реакции окисления люциферина [4], сопровождающейся испусканием кванта света. Однако наиболее распространенный тип окраски обусловлен накоплением в покровах или в специализированных клетках пигментов: меланинов, оммохромов, птеринов, билинов и каротиноидов. Если большинство перечисленных пигментов насекомые способны синтезировать самостоятельно, то каротиноиды могут быть получены только с пищей (редкое исключение представляют тли, получившие кластер генов синтеза каротиноидов от грибов в ходе горизонтального переноса генов) [5].
Каротиноиды —
пигменты изопреноидной природы, широко распространены среди фотосинтезирующх организмов, у которых они выполняют функции сбора и передачи энергии синего спектра. Они также встречаются и у гетеротрофных организмов, таких как грибы и бактерии, в которых выполняют функции антиоксидантов и фотопротекторов. У позвоночных особая роль каротиноидов связана с работой органов зрения. Фоторецепторы сетчатки [6], [7] (родопсины и конопсины) используют в качестве кофактора ретиналь (витамин А, образующийся из β-каротина), а место наибольшей концентрации фоторецепторов — желтое пятно сетчатки — содержит большое количество каротиноидов зеаксантина и лютеина, где они выполняют фотозащитную функцию у млекопитающих или функцию светофильтра у птиц [8]. Более того, производные каротиноидов могут выполнять роль молекул-регуляторов: абсцизовая кислота [9] у растений регулирует процессы приспособления к стрессовым условиям и покоя семян, а ретиноевая кислота у животных играет важную роль в процессах эмбрионального развития [10] и поддержания слизистых оболочек и кожи [11]. Зачастую для транспорта и накопления каротиноидов — крайне гидрофобных соединений — требуются высокоспецифичные водорастворимые каротиноид-связывающие белки.
На данный момент подробно охарактеризовано лишь шесть таких белков (рис. 1), два из которых — β-каротин связывающий белок (BBP) и каротиноид-связывающий белок BmCBP — участвуют в формировании окраски насекомых. BBP при накоплении в покровах пустынной саранчи Sсhistocerca gregaria обеспечивает яркую сигнальную окраску самцов в период массовых миграций [12], [13]. Каротиноид-связывающий белок тутового шелкопряда Bombyx mori BmCBP обеспечивает перенос каротиноидов [14] в просвет прядильной железы через клетки эпителия, придавая производимому шелку золотистый цвет. Эти белки не только выполняют разные функции, но и обладают совершенно разными структурами и относятся к разным семействам. Ранее было показано, что каротиноиды присутствуют в окраске бабочек, кузнечиков, палочников и богомолов, однако белки, обусловливающие их накопление, идентифицированы не были. Рисунок 1. Структуры известных водорастворимых каротиноид-связывающих белков. коллаж авторов Это навело нас на мысль о том, что в разных группах насекомых существуют различные белки, независимо приобретшие функцию переноса или накопления каротиноидов. С этой светлой мыслью прошлой весной мы обратились к заведующим кафедрами биохимии и энтомологии Биологического факультета МГУ с предложением провести самостоятельную работу в рамках летней практики на Звенигородской биостанции для студентов первого курса. Идея заключалась в том, чтобы попробовать найти у насекомых Подмосковья новый каротиноид-связывающий белок, участвующий в формировании окраски. Работа имела как научную новизну и значимость, так и была интересна с образовательной точки зрения, поскольку сочетала в себе элементы полевой и лабораторной биологии. Более того, цветные белки представляются очень наглядными объектами для обучения. "Добро" было получено, и мы с целой машиной лабораторного оборудования выдвинулись на биостанцию.
Про авторов и лабораторию
Никита Алексеевич Егоркин, аспирант кафедры биохимии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, младший научный сотрудник лаборатории белок-белковых взаимодействий ФИЦ Биотехнологии РАН. Николай Николаевич Случанко, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник ФИЦ Биотехнологии РАН, заведующий лабораторией белок-белковых взаимодействий. Одним из направлений нашей лаборатории является изучение каротиноид-связывающих белков, их свойств, структуры, эволюции и возможностей применения. Для выбора объекта исследования мы собрали целую коллекцию из различных насекомых, обитающих в окрестностях (рис. 2). Ребята скрупулезно определили и сфотографировали собранных насекомых, а также проанализировали содержание в них каротиноидов методом тонкослойной хроматографии. Рисунок 2. Некоторые яркие насекомые, собранные и определенные на Звенигородской биостанции студентами. фотографии Ярослава Шилана В качестве объекта исследования был выбран распространенный в окрестностях биостанции певчий кузнечик Tettigonia cantans, покровы которого окрашены в яркий зеленый цвет и содержат большое количество каротиноида лютеина. По данным литературы мы знали, что зеленая окраска кузнечика образована комбинацией каротиноидов и билинов: первые работы были проведены еще в 1882 году [15] и продолжались до 1950-х, однако данных о том, какие белки участвуют в этом процессе, не нашлось. Чтобы определить, находится ли каротиноид в комплексе с водорастворимым белком или связан с нерастворимыми компонентами кутикулы или клеток эпителия, мы провели гель-фильтрационную хроматографию тканевого экстракта. Гель-фильтрационная хроматография позволяет разделять макромолекулы в соответствии с их размером по принципу обратного сита: раньше всего с колонки "сходят" макромолекулы или их агрегаты наиболее крупного размера, а меньшие по размеру макромолекулы и низкомолекулярные соединения — позже всего. Больше об открытии хроматографии (волею случая, исторически неразрывно связанной с цветом и Цветом), можно прочесть в статье "Возвращение Цвета" [16], а "базу" "Биомолекула" давала в спецпроекте "12 методов в картинках": "Очистка молекул и разделение смесей" [17]. Мы ожидали обнаружить желтую окраску в одной из средних или поздних фракций. Фактически же на протяжении всей хроматографии мы наблюдали движение по колонке ярко-зеленого пятна, которое при при элюции выглядело как раствор со слабым зеленоватым оттенком из-за разведения на колонке. Отдельным приключением было сконцентрировать его при помощи настольной центрифуги, но мы справились и с этой трудной задачей: в наших руках была пробирка изумрудно-зеленого раствора белка, по цвету практически неотличимого от зеленых листьев, в которых он должен был помочь спрятаться кузнечику, которому не повезло столкнуться с нами. Чтобы понять, содержит ли выделенная нами зеленая фракция каротиноиды, мы провели ацетон-гексановую экстракцию . Это частный случай метода жидкостно-жидкостной экстракции, который позволяет экстрагировать в верхний слой органического растворителя неполярные соединения (к которым относятся каротиноиды); полярные же соединения остаются в нижней водной фазе. К нашему удивлению, зеленый раствор разделился: верхняя гексановая фаза приобрела желтый цвет, а водная — небесно-голубой оттенок. Из литературы мы знали, что зеленая окраска насекомых может быть обусловлена одновременным присутствием двух пигментов (каротиноидов и билинов), однако точной информации о том, находятся ли они в разных белках или в одном, у нас не было. Таким образом, за неделю практики на Звенигородской биостанции летом 2024 года (рис. 3) нам удалось сделать маленькое открытие, положившее начало большой работе. Previous раскрыть в полном размере раскрыть в полном размере раскрыть в полном размере Next1/3 Рисунок 3А. Первооткрыватели зеленого белка кузнечика на Звенигородской биостанции: студенты первого курса биологического факультета МГУ вместе с преподавателями. фото авторов статьи Уже в лаборатории в Москве нам удалось провести гель-фильтрационную хроматографию, позволяющую наблюдать спектр поглощения прямо в процессе разделения образца на колонке. Спектр поглощения препарата и расположение пиков поглощения на хроматограмме однозначно продемонстрировали присутствие каротиноида и билина в одном белке (рис. 4). Идентификация каротиноида не составила труда: методом ВЭЖХ мы подтвердили, что с белком связан лютеин. Определение же билина потребовало значительных усилий по выделению и анализу методом масс-спектрометрии MALDI-TOF, но окончательно его загадка разрешилась только с получениемструктуры белка. Осознав уникальность момента открытия белка, мы, не без доли здоровой иронии, между собой дали ему звучное, но сугубо научное название дибилиноксантинин ( ди — два пигмента, билино — билин, ксантин — ксантофилл лютеин, ин — суффикс, обозначающий белковую природу), которое позже стало официальным. Рисунок 4. Получение зеленого белка из покровов певчего кузнечика Tettigonia cantans. коллаж авторов статьи
Билины, или желчные пигменты —
линейные тетрапирролы. Циклические тетрапирролы — известные всем гем крови и хлорофилл; содержат четыре пиррольных кольца, соединенных метиленовыми или метиновыми мостиками. Если один из мостиков между пиррольными кольцами разорвать с помощью окисления, образуются линейные тетрапирролы — билины. Именно билины (билирубин, биливердин) дают цвет, например, синякам, содержатся в желчи и вызывают изменение цвета кожи при желтухе [18]. Более того, билины являются фотосинтетическими пигментами цианобактерий (компоненты фикобилисом) и распространенными пигментами у насекомых (одними из первых структурно охарактеризованных цветных водорастворимых белков были билин-связывающие белки инсектицианины).
Получив достаточное количество высокоочищенного препарата белка, мы попытались охарактеризовать его физико-химические свойства. Оказалось, что он обладает высокой термостабильностью и не разрушается вплоть до 68oC, что, по всей видимости, важно для белков, обеспечивающих окраску покровов. Однако наиболее удивительным свойством оказалась способность белка оставаться функциональным при экстракции каротиноида органическими растворителями. Таким образом, нам удалось получить растворимый белок небесно-голубого цвета, в который можно было вернуть обратно как экстрагированный каротиноид, так и какой-нибудь другой каротиноид, несвойственный для него. При анализе молекулярной массы дибилиноксантинина методом денатурирующего электрофореза [17] мы обнаружили полосу белка с молекулярной массой 19 кДа и две полосы с массами близкими к 11 кДа, что свидетельствовало о том, что белок либо состоит из разных фрагментов, либо исходный белок-предшественник подвергся разрезанию протеазами. Для объяснения этого феномена мы исследовали как препарат цельного белка, так и отдельные его фрагменты методом масс-спектрометрии, а также провели секвенирование N-конца методом деградации по Эдману. Прочитанных пептидов оказалось достаточно для дизайна праймеров и дальнейшей амплификации и секвенирования фрагмента мРНК. Несмотря на то, что на данный момент отсеквенированы геномы лишь трех видов кузнечиков, и наш объект не входит в их число, нам удалось определить, что все цепи пренадлежат одному процессированному белку. Ближайшим известным гомологом дибилиноксантинина оказался вителлогенин-3 из Anabrus simplex — кузнечика, обитающего в Северной Америке.
Вителлогенины —
важные гликолипопротеины, встречающиеся у почти всех яйцекладущих и яйцеживородящих видов животных. Их основная функция — транспорт и запасание липидов в яйцах и участие в эмбриональном развитии, в связи с чем их экспрессия характерна для самок. Однако было показано, что вителлогенины могут выполнять и другие функции, а также функционировать в организме самцов.
Для вителлогенинов свойственен интенсивный процессинг и гликозилирование, и наш белок не стал исключением в этом плане. Однако необычно было то, что самцы и самки были одинаково зелеными, что свидетельствовало об одинаковом уровне экспрессии исходного вителлогенина, процессированным фрагментом которого является дибилиноксантинин. Более того, оказалось, что для вителлогенинов уже была показана способность связывать билины или каротиноиды в отдельности, однако их одновременное нахождение их в таком белке было показано нами впервые. Для того, чтобы окончательно разобраться с тем, каким образом белок связывает сразу два различных по природе хромофора, мы подвергли его кристаллизации. Выращенный кристалл белка исследовали методом рентгеноструктурного анализа [19], и, поскольку открытый белок обладает уникальной укладкой, нам предстояло решить настоящую головоломку для построения пространственной модели его структуры (рис. 5). Надо сказать, что несмотря на важную роль вителлогенинов, структура ни одного из них до сих пор не была решена. Таким образом, сами того не подозревая, мы решили сразу две загадки. Рисунок 5. Структура дибилиноксантинина. Верхний ряд — полноразмерная структура с разных ракурсов, нижний — структура в тех же положениях, с удаленными фрагментами для демонстрации содержимого внутренней полости. Голубым и зеленым цветом выделены полипептидные цепи, синим — молекулы билинов, оранжевым — молекулы лютеинов, а желтым — фосфатидилхолинов. Посмотреть и покрутить 3D-модель структуры можно по ссылке. Дибилиноксантинин оказался устроен достаточно замысловатым образом. В первую очередь, он оказался димером, то есть каждый из трех протеолитических фрагментов исходного предшественника был представлен в структуре белка дважды. Сама структура белка напоминала капсулу, обладающую обширной внутренней полостью. Ее стенки образованы изогнутым в виде арки β-складчатым слоем, закрытым с боков двумя идентичными β-складчатыми доменами, а снизу — несколькими α-спиральными фрагментами. Структура оказалась уникальной, лишь отдельные участки имеют отдаленное структурное сходство с фактором фон Виллебранда (один из факторов свертываемости крови) и рецептором энтеробактина. Интереснее всего оказалось наполнение этой полости: внутри белка находились две молекулы лютеина, две молекулы билина и, неожиданно, четыре молекулы фосфатидилхолина. При этом вытянутая молекула лютеина была зажата между боковыми цепями аминокислотных остатков, образующих соседние β-складки, как сосиска в датском хотдоге, в то время как билин был зафиксирован полярными контактами и ароматическими остатками. Более того, мы наконец смогли совместить данные масс-спектрометрии билина со структурой и обнаружить еще одну интересную особенность. Наиболее распространенным билином является биливердин, который образуется из гема B (именно он находится в гемоглобине), однако в гидрофобной полости нашего белка мы обнаружили билин, содержащий дополнительно длинный фарнезильный хвост. Такая группа характерна для гема А, функционирующего в электрон-транспортной цепи митохондрий. Таким образом, билиновый пигмент в составе дибилиноксантинина должен быть продуктом окисления гема А и носить название гидроксиэтилфарнезил мезобиливердин (рис. 6). Рисунок 6. Формулы гидроксиэтилфарнезил мезобиливердина — синего компонента окраски кузнечика и гема А, из которого он, вероятно, образуется. Вдохновившись уникальностью полученной структуры, мы решили проверить, насколько распространен такой механизм формирования зеленой окраски. Однако поиск гомологов показал, что близкие по последовательности белки распространены только среди настоящих кузнечиков (Tettigoniidae), в то время как у родственной им саранчи близкого гомолога найти не удалось. Это оказалось вдвойне удивительно, ведь среди саранчи (Acrididae) тоже встречается зеленая окраска. Тогда мы, поискав среди запасенных с лета образцов, выбрали несколько зеленых насекомых, относящихся к разным отрядам, и дополнительно взяли зеленого паука, относящегося аж к другому классу членистоногих. С ними мы вернулись к исходному методу — аналитической гель-фильтрационной хроматографии, однако на этот раз, в отличие от работы на биостанции, у нас была возможность наблюдать спектр поглощения образца в режиме реального времени. К нашему удивлению, мы обнаружили, что у всех всё по-разному: так, другой кузнечик Phaneroptera falcata ожидаемо продемонстрировал наличие дибилиноксантинина с идентичным спектром поглощения, в то время как у кобылки Euthystira brachyptera каротиноиды и билины находились в разных белках (рис. 7). Аналогичная ситуация наблюдалась у гусениц точечного мотылька Melanchra persicariae и табачного бражника Manduca sexta: в первом случае оба пигмента находились в одном белке большего размера, чем дибилиноксантинин, в то время как во втором случае каротиноиды и билины содержались в разных белках. Самым удивительным открытием стало то, что окраска зеленого паука Micrommata virescens, часто встречающегося в окрестностях биостанции, также обусловлена крупным белком, содержащим в себе одновременно оба пигмента. Таким образом, можно предположить, что механизм зеленой окраски, при котором оба пигмента находятся в одном белке в строгом стехиометрическом соотношении, возникал многократно в разных группах наземных членистоногих в ходе их эволюции. Рисунок 7. Водорастворимые компоненты зеленой окраски некоторых наземных членистоногих, проанализированные методом гель-фильтрации. В левом столбце приведены профили элюции, зарегистрированные по поглощению света при длине волны 280 нм (область поглощения белка), 460 нм (область поглощения каротиноида) и 660 нм (область поглощения билина); в правом — спектры поглощения фракций, соответствующих хроматограмм. Желтой полосой отмечена область спектра поглощения каротиноидов, синей — билинов. Нам стало очень интересно, какой белок в случае зеленого паука отвечает за формирование зеленой окраски. Однако был самый разгар зимы, а в наших запасах остался лишь один такой паук, собранный еще летом. Права на ошибку не было, но нам удалось придумать методику очистки, состоящую из хроматографии и нескольких видов электрофореза, позволившую очистить малое, но тем не менее достаточное количество белка для его идентификации методом масс-спектрометрии. К нашей огромной радости, зеленый белок из паука тоже оказался разновидностью вителлогенинов. Таким образом, наше предположение о многократном появлении в процессе эволюции дибилиноксантинин-подобных белков укрепилось еще сильнее. Вероятнее всего, вителлогенины имеют предрасположенность к приобретению функции белка-пигмента, чему способствуют как особенности его строения, так и возможность гибкой перестройки регуляции его экспрессии в организмах самцов и самок. Все полученные данные были собраны воедино в компактную статью с небольшим приложением и опубликованы в журнале PNAS [20]. Таким образом, спустя практически полтора века с момента первых изысканий на тему того, почему кузнечики зеленые, после стольких вопросов "почему?", заданных детьми, мы, наконец, можем с облегчением ответить: Дорогие дети, всё очень просто: кузнечики зеленые, потому что в их покровах накапливается белок дибилиноксантинин, связывающий одновременно желтый каротиноид лютеин и синий гидроксиэтилфарнезилированный мезобиливердин, комбинация спектров поглощения которых в правильной пропорции дает оттенок цвета, практически неотличимый глазом от цвета травы, в которой эти самые кузнечики и прячутся от хищников (и нас с вами). Но не все насекомые зеленые из-за дибилиноксантинина: у кого-то так, у кого-то по-другому, но это нам только предстоит выяснить. В заключение нашей истории хотелось бы добавить, что открытие порой может быть прямо перед вашими глазами, достаточно лишь присмотреться повнимательнее.
Рисунок 1. Структуры известных водорастворимых каротиноид-связывающих белков. коллаж авторов 
Рисунок 2. Некоторые яркие насекомые, собранные и определенные на Звенигородской биостанции студентами. фотографии Ярослава Шилана 
раскрыть в полном размере 
раскрыть в полном размере 
раскрыть в полном размере Next1/3 Рисунок 3А. Первооткрыватели зеленого белка кузнечика на Звенигородской биостанции: студенты первого курса биологического факультета МГУ вместе с преподавателями. фото авторов статьи Уже в лаборатории в Москве нам удалось провести гель-фильтрационную хроматографию, позволяющую наблюдать спектр поглощения прямо в процессе разделения образца на колонке. Спектр поглощения препарата и расположение пиков поглощения на хроматограмме однозначно продемонстрировали присутствие каротиноида и билина в одном белке (рис. 4). Идентификация каротиноида не составила труда: методом ВЭЖХ мы подтвердили, что с белком связан лютеин. Определение же билина потребовало значительных усилий по выделению и анализу методом масс-спектрометрии MALDI-TOF, но окончательно его загадка разрешилась только с получениемструктуры белка. Осознав уникальность момента открытия белка, мы, не без доли здоровой иронии, между собой дали ему звучное, но сугубо научное название дибилиноксантинин ( ди — два пигмента, билино — билин, ксантин — ксантофилл лютеин, ин — суффикс, обозначающий белковую природу), которое позже стало официальным. 
Рисунок 4. Получение зеленого белка из покровов певчего кузнечика Tettigonia cantans. коллаж авторов статьи 
Рисунок 5. Структура дибилиноксантинина. Верхний ряд — полноразмерная структура с разных ракурсов, нижний — структура в тех же положениях, с удаленными фрагментами для демонстрации содержимого внутренней полости. Голубым и зеленым цветом выделены полипептидные цепи, синим — молекулы билинов, оранжевым — молекулы лютеинов, а желтым — фосфатидилхолинов. Посмотреть и покрутить 3D-модель структуры можно по ссылке. 
Рисунок 6. Формулы гидроксиэтилфарнезил мезобиливердина — синего компонента окраски кузнечика и гема А, из которого он, вероятно, образуется. 
Рисунок 7. Водорастворимые компоненты зеленой окраски некоторых наземных членистоногих, проанализированные методом гель-фильтрации. В левом столбце приведены профили элюции, зарегистрированные по поглощению света при длине волны 280 нм (область поглощения белка), 460 нм (область поглощения каротиноида) и 660 нм (область поглощения билина); в правом — спектры поглощения фракций, соответствующих хроматограмм. Желтой полосой отмечена область спектра поглощения каротиноидов, синей — билинов.