Малое в большом, большое в малом... Эндофитные гри...
Малое в большом, большое в малом... Эндофитные грибы и бактерии в защите растений от фитофагов
20 января 2021, 06:23
Статья на конкурс "Био/Мол/Текст": Оказывается, зачастую токсины ядовитых растений синтезируют не сами растения, а обитающие внутри них микроскопические грибы-эндофиты, находящиеся с растениями в относительно дружественных отношениях. По-видимому, для растений это выгодно, несмотря на то, что грибы-квартиранты при неблагоприятных условиях могут повести себя некрасиво и перейти к паразитическому образу жизни, а многие эндофиты даже уничтожают часть семян растения и используют их для собственного размножения. Тем не менее токсины грибов-эндофитов оказываются настолько сильнодействующими, что "отваживают" травоядных животных и насекомых от поедания целых популяций растений. Вместе с растениями не поедаются и их квартиранты. Все счастливы и довольны. Кроме, конечно, травоядных животных, у которых, несмотря на все фитосанитарные меры, до сих пор нередко случаются массовые отравления токсинами эндофитных грибов. А вплоть до начала ХХ века отравления такими токсинами, известные как "ведьмины корчи", "антонов огонь" и др., регулярно случались в разных странах мира.
Эта работа опубликована в номинации "Вирусы и микроорганизмы" конкурса "Био/Мол/Текст"-2020/2021. Генеральный партнер конкурса — ежегодная биотехнологическая конференция BiotechClub, организованная международной инновационной биотехнологической компанией BIOCAD. Спонсор конкурса — компания SkyGen: передовой дистрибьютор продукции для life science на российском рынке. Спонсор конкурса — компания "Диаэм": крупнейший поставщик оборудования, реагентов и расходных материалов для биологических исследований и производств. "Книжный" спонсор конкурса — "Альпина нон-фикшн" В силу своей неспособности убегать или активно обороняться, растения вынуждены искать другие способы защиты от поедания растительноядными животными (фитофагами), например, синтез ядовитых для них веществ. Однако, по оценкам специалистов, только от 10 до 25% высших растений "умеют" синтезировать токсины [1]. В их число, кстати, не входят злаки — одни из самых лакомых и доступных для травоядных животных растений. При этом практически все злаки, да и большинство других растений, заселены эндофитными микроорганизмами — микроскопическими грибами или бактериями, обитающими внутри растения — в межклетниках, клеточных стенках, просветах сосудисто-волокнистых пучков; некоторые, особенно дрожжи и бактерии, обнаруживаются и прямо внутри клеток растений [2]. Они синтезировать токсины как раз умеют, и, по-видимому, именно для того, чтобы не дать съесть своего хозяина и не быть съеденным вместе с ним. Каких-либо повреждений тканей или иммунных реакций со стороны растения эндофитные грибы и бактерии, как правило, не вызывают. Напротив, они могут отплатить "за стол и дом" стимуляцией роста растения, повышением его устойчивости к засухе, морозам или засолению, а также противостоянием патогенным микроорганизмам и растительноядным животным [3]. Таким образом, взаимоотношения растений и эндофитных микроорганизмов вполне вписываются в рамки мутуализма — взаимовыгодного сожительства. Однако, как мы увидим далее, далеко не все так однозначно. Но все же, в любом случае, микроорганизмы — более искушенные биохимики, чем растения, и способны продуцировать более широкий спектр биологически активных веществ — ферментов, гормонов, регуляторов роста и в том числе токсичных веществ. Так почему бы не поручить синтез токсинов для защиты от фитофагов им?
Алкалоиды эндофитных грибов
Эндофитные грибы распространены в природе очень широко и найдены пытливыми исследователями абсолютно во всех группах растений. Какое бы растение, какой бы его орган мы не взяли: хвою сосны, стебель кактусов, листья сфагновых мхов, слоевище морских водорослей, с высокой долей вероятности можно утверждать, что кто-нибудь когда-нибудь обнаруживал там мицелий или отдельные клетки грибов-эндофитов. Это могут быть представители самых различных по систематическому положению и экологии групп грибов: базидиомицетовые дрожжи — Rhodotorula; аскомицетовые дрожжи Williopsis, Candida; "типичные" фитопатогенные аскомицеты — Alternaria, Didymella, Fusarium; "плесневые" грибы — Mucor, Aspergillus и Penicillium; узкоспециализированные эндофиты, выделяемые исключительно из растительных тканей, — Phialocephala; и др. [3]. Разные виды эндофитных грибов в разной степени специализированы в отношении растения-хозяина — одни долгое время поддерживают с ним взаимовыгодные или, как минимум, нейтральные отношения, другие — легко перескакивают от мутуализма к паразитизму. Эндофитные грибы злаков в основном относят к семейству Clavicipitaceae (спорыньевые), отдела Ascomycota. Наиболее часто встречаются виды рода Neotyphodium, Epichloë (половая стадия Neotyphodium) и собственно Claviceps (спорынья) [4]. Алкалоиды эндофитных грибов злаков наиболее подробно изучены, и, в зависимости от химического строения подразделяются на 4 группы (табл. 1).
Таблица 1. Группы алкалоидов эндофитных грибов злаков
Эрготные алкалоиды
Индолдетерпены
Пирролопиразины (перамины)
Насыщенные аминопирролизидины (лолины)
Примеры алкалоидов
Эрговалин, клавины и простые амиды лизергиновой кислоты (эргин, эргоновин, эрготамин)
Паксиллин, лолитрем В
Перамин
Норлолин, N-ацетиллолин и N-формиллолин
Примеры растений-хозяев
Рожь, пшеница, ячмень, многие кормовые злаки
Плевел многолетний ( Lolium perenne) и др. кормовые злаки: овсяница, плевел, костер, мятлик
Плевел многолетний ( Lolium perenne) и др. кормовые злаки: овсяница, плевел, костер, мятлик
Плевел опьяняющий ( Lolium temulentum L.), овсяница тростниковая ( Lolium arundinaceum), плевел многолетний, или райграс пастбищный ( Lolium perenne), и др. виды этого рода
Токсичность
Травоядные млекопитающие, в том числе человек; некоторые (эрговалин) также токсичны для насекомых
Травоядные млекопитающие
Насекомые: различные виды тли, долгоносиков, тараканов, личинок чешуекрылых
Травоядные млекопитающие, насекомые
Токсическое действие
Нарушение кровообращения, терморегуляции, репродуктивной функции, лактации
Нейротоксины —нарушения координации, тремор
Пищевые репелленты — вещества, вызывающие отвращение к пище у насекомого и прекращение его питания
У травоядных животных: паралич нервной системы, помрачение сознания, нарушение дыхания, мышечная атрофия
Среди них три группы — эрготные алкалоиды, индолтерпены и лолины, обладают токсичностью для травоядных животных, в том числе человека. Для пераминов известно только инсектицидное действие; также для насекомых токсичны лолины и некоторые эрготные алкалоиды. Перамины и лолины уникальны тем, что иногда оказываются для растений едва ли не единственным средством защиты от сосущих вредителей типа тлей и цикадок, которые способны подавлять собственные защитные реакции растений [5]. Для каждого вида злаков характерен свой вид грибов-эндофитов, а каждый вид эндофитных грибов синтезирует определенный набор токсинов. Например, Epichloë coenophiala — эндофит овсяницы тростниковой ( Festuca arundinacea) — синтезирует эрготные алкалоиды, перамины и лолины [6]. Для плевела опьяняющего ( Lolium temulentum L.) характерен эндофитный гриб Epichloë occultans, образующий лолины и эрготные алкалоиды [5]. Интересно, что чем "теснее" взаимоотношение эндофитного гриба с растением и чем ближе они к мутуализму, тем старательнее эндофиты синтезируют токсины. В частности, эндофиты, которые утратили половые стадии и размножаются, колонизируя завязь и семя дочерних растений (рис. 1), всегда продуцируют токсины в бóльших количествах, чем те, что формируют половые стадии и распространяются среди других растений [7]. Рисунок 1. Схема вертикальной передачи мицелия эндофитного гриба Epichloë festucae от материнского растения к дочернему через завязь и семена.а — Сохранение мицелия эндофитного гриба в зараженном семени. б — Развитие мицелия в тканях прорастающих всходов. в и г — Распространение мицелия по вегетативным органам растения. д — Проникновение мицелия в ткани завязи без ее повреждения; мицелий сохраняется после оплодотворения в семени. Seed transmission of Epichloë endophytes in Lolium perenne is heavily influenced by host genetics Практически все алкалоиды обладают очень высокой токсичностью — достаточно примерно 0,5 мг (!) эрготных алкалоидов на 1 кг сухого веса корма [8], чтобы у крупного рогатого скота появились симптомы отравления. Это могут быть нарушения кровообращения, например, так называемая овсяничная стопа — опухоль, некроз и отслаивание копыта из-за снижения циркуляции крови в стопе, вызванного сосудосуживающим действием эрговалина. Эрготные алкалоиды также снижают перистальтическую активность ЖКТ, из-за чего животные плохо усваивают корм, теряют в весе, у них портится шерсть. Особая опасность в том, что действие эрготных алкалоидов направлено не только на ныне существующее поколение травоядных животных, но и на их потомство — эрготные алкалоиды снижают содержание пролактина и лютеинизирующего гормона, в результате чего у беременных кобыл и коров могут наблюдаться выкидыши, мертворождения и снижение лактации [9]. Для человека эрготные алкалоиды тоже ядовиты и при употреблении склероциев спорыньи в составе муки и хлеба вызывают комплекс симптомов, известных под названием "эрготизм". Основные его проявления — это значительные нарушения кровообращения в конечностях, сопровождающиеся жгучими болями, онемением, отмиранием мягких тканей (гангренозная форма) и поражение нервной системы в виде судорог и галлюцинаций (конвульсивная форма) [10]. В Средние века данные симптомы были известны, как "Антонов огонь" (Святой Антоний считался покровителем заболевших) и "Ведьмины корчи". Вплоть до конца XIX — начала XX века заболевание эрготизмом носило в отдельные годы эпидемический характер, и о причинах его практически не было достоверных сведений, хотя еще в 1670-е годы французский врач Луи Тулье совершенно правильно предположил, что виной всему "маточные рожки" — склероции спорыньи, встречающиеся на колосьях ржи [10]. Тулье заметил, что чаще заболевают бедные классы населения, основу питания которых составляет ржаной хлеб, при этом члены одной семьи, как правило, заражаются, а ближайшие соседи — часто нет. Отсюда можно было сделать вывод, что болезнь не является инфекционной и не передается при общении или питье из одного источника, а возникает при употреблении одной и той же пищи — в частности, ржаной муки и хлеба. Интересно, кстати, что эрготные алкалоиды являются термостойкими и сохраняют свою токсичность в процессе выпечки хлеба при высокой температуре. Несмотря на правильность предположений Луи Тулье, эрготизм "свирепствовал" во многих странах мира до тех пор, пока рожь не стала вытесняться картофелем, а токсичность спорыньи не была доказана экспериментально Артуром Штолем в 1918 году [10]. В настоящее время, благодаря современным технологиям выращивания, хранения, переработки и контроля качества зерна, эпидемии такого рода остались в прошлом.
Эндофитные бактерии в защите от фитофагов
Практически все органы и ткани растений (нередко даже семена и пыльцевые зерна!) населены эндофитными бактериями, формирующими специфические сообщества. При этом, по-видимому, растения способны избирательно допускать в свою эндосферу только определенный "набор" бактерий, формируя свой индивидуальный микробиом [11]. Эндофитные бактерии, вероятно, в большей степени специализированы против фитопатогенов, чем фитофагов. Хорошо изучена способность эндофитных бактерий к синтезу соединений, обладающих антифунгальной (противогрибковой) и антибактериальной активностями в отношении фитопатогенных грибов и бактерий — потенциальных конкурентов эндофитов за "обладание" растением. Кроме того, эндофитные бактерии часто стимулируют иммунитет растения — так называемую системную индуцированную устойчивость ( СИУ), которая может быть выражена, например, в отложении каллозы — полисахарида, укрепляющего клеточные стенки, — в продукции различных антибиотиков и других защитных реакциях [12]. Происходит это потому, что, будучи вроде бы дружественными или как минимум нейтральными по отношению к растению, эндофитные бактерии все-таки воспринимаются им как чужеродные и запускают реакции, подобные тем, что активируются при "нападении" на растение патогенных микроорганизмов. Специфические соединения, токсичные для насекомых или травоядных млекопитающих, у эндофитных бактерий пока не были обнаружены, однако выявлено, что присутствие некоторых штаммов-эндофитов в тканях растения может вызывать гибель насекомых-вредителей. Так, например, описано увеличение смертности личинок колорадского жука и хлопковой совки при поедании ими листьев, колонизированных определенными штаммами B. subtilis и В. amyloliquefaciens. При этом культуральная жидкость бактерий сама по себе не вызывала гибели насекомых, поэтому предполагают, что эндофитные бактерии способствуют гибели насекомых-фитофагов именно за счет активации защитных реакций растения-хозяина [13].
Друзья-враги и враги-друзья
Есть как минимум две причины, по которым эндофитам выгодно существовать, не повреждая клетки растения-хозяина:
Разрушение клеточных стенок вызвало бы сильную иммунную реакцию у растения, направленную на отторжение заселенных эндофитами тканей.
Размножение большинства эндофитов связано с размножением растения-хозяина: либо внутри вегетативных органов, либо через завязь и семя [14].
Следовательно, жизнедеятельность эндофитов сопряжена с жизнедеятельностью растений, и обычно они придерживаются стратегии "не рубить сук, на котором сидят". Однако мирное динамическое равновесие со своими эндофитами возможно только при отсутствии сильных стрессовых влияний на растение [3]. В стрессовых же условиях, некоторые эндофиты не брезгуют перейти к паразитическому образу жизни и "добить" своего партнера. Так, например, в одном исследовании [15] показано, что в условиях нормального минерального питания проростки плевела многолетнего, заселенные эндофитным грибом Neotyphodium lolii, лучше усваивают минеральные соли и имеют большую биомассу, при недостатке же минеральных веществ, проростки, заселенные эндофитами, наоборот, развиваются хуже и чаще погибают, чем незаселенные. Среди эндофитов рода Epichloë некоторые виды развиваются бессимптомно, другие — могут при переходе к половому размножению формировать мицелий, окольцовывающий стебель снаружи — так называемую чехловидную болезнь злаков (рис. 2). Рисунок 2. Мицелиальный "чехол" Epichloë на стеблеAranzadi Мицелиальные чехлы не препятствуют росту вегетативных побегов, и даже наоборот, стимулируют их рост, однако, у некоторых видов подавляют цветение. Тем не менее в большинстве исследований не обнаружено значительного влияния чехловидной болезни на продуктивность зараженных растений. Вредоносность чехловидной болезни обусловлена именно опасностью отравления сельскохозяйственных животных при поедании зараженных кормовых трав. Предполагают, что более дружественные к растениям виды Neotyphodium происходят от видов Epichloë, утративших способность к половому размножению и формированию "чехлов". В благодарность за такое "мягкое обращение" злаки "позволяют" гифам Neotyphodium проникать в семена и таким образом колонизировать дочерние растения [16]. Вообще граница между мутуализмом и паразитизмом эндофитов, как это часто бывает, сильно размыта. Некоторые виды грибов, считающихся типичными фитопатогенами, например, та же спорынья — Claviceps на самом деле балансирует на грани паразитизма и мутуализма в растении. С одной стороны, ее гифы распространяются в завязи и убивают зародыш, с другой стороны — питается она в целом биотрофно, то есть не повреждая клетки, и к гибели хозяина не приводит. Более того, спорынья разрушает завязи злаков лишь в некоторых цветках небольшого числа растений, и на популяционном уровне это может оказаться выгодным. Ведь яд спорыньи, накапливаемый в склероциях, оказывается настолько сильным, что небольшой его примеси в зерне хватает на то, чтобы "свалить с ног" целое стадо и защитить от поедания крупными млекопитающими всю популяцию растений. На месте разрушенных завязей спорынья формирует склероции — темные продолговатые образования плотно сплетенных нитей мицелия, из которых при благоприятных условиях произрастают впоследствии плодовые тела довольно "инопланетного" вида (рис. 3). Весьма вероятно, кстати, что склероции спорыньи — это те самые "чернушки", от которых Баба-Яга велела Василисе Прекрасной очистить пшеницу в одноименной сказке. Рисунок 3а. Склероций спорыньи в колосе пшеницыClaviceps purpureaРисунок 3б. Прорастание плодовых тел из склероция "Топ-10 самых ядовитых грибов в мире" Широко распространенные фитопатогенные грибы р. Fusarium вызывают такие заболевания растений, как фузариоз колоса, снежная плесень, фузариозное увядание, корневые гнили и др., и производят опасные токсины: дезоксиниваленол, зеараленон, Т-2-токсин и др. необходимые грибам, чтобы травоядные животные не съели их вместе с растением или с его семенами, пока они сами эти растения потихоньку не съедят... Тем не менее даже среди этих коварных проглотов имеются виды, обратившиеся от паразитического или сапротрофного образа жизни к относительно мирному эндофитному существованию. Например, обнаружен изолят F. oxysporum — эндофит бананового дерева ( Musa spp.), — не вызывающий симптомов фузариоза у растения-хозяина, но токсичный для паразитических нематод Radopholus similis [17].
Охотники в засаде
Оказывается, некоторые эндофиты квартируют в растении лишь временно и, не имея намерения питаться за его счет, претендуют на заражение растительноядных насекомых, привлекаемых растением. Таким образом энтомопатогенные (патогенные для насекомых) эндофиты в отличие от обычных эндофитов, имеют своей целью не защиту себя и "своего" растения от поедания, а нападение на насекомого, питающегося на растении. Насекомое вместе с тканями растения поглощает частички мицелия гриба, которые далее развиваются в теле насекомого. Применяемые в биологической защите растений энтомопатогенные грибы Beauveria bassiana, Metarhizium spp, Lecanicillium spp и Isaria spp были обнаружены в тканях самых различных растений: от культурных злаков и картофеля до артишока, кофе, банана, хлопка, джута, сосны и др. [18]. Есть предположение, что стадия эндофитного бессимптомного существования — скорее правило, чем исключение для многих энтомопатогенных грибов. Энтомопатогенные бактерии также могут существовать эндофитно. В природе обнаружены эндофитные штаммы энтомопатогенной бактерии Bacillus thuringiensis, заражающие тлей и других насекомых-вредителей при питании на растении.
Третий не лишний
В сложных и неоднозначных взаимодействиях растений с эндофитами могут принимать участие и другие организмы: насекомые, нематоды, вирусы... Прежде всего, дело касается расселения эндофитных микроорганизмов. Фитопатогенные нематоды рода Anguina поселяются в зародышах семени злаков, уничтожают их и формируют галлы, заполненные личинками, которые покидают галлы и поражают молодые всходы (рис. 4 а). Очень часто в теле нематод бессимптомно обитают бактерии Clavibacter (Rathayibacter) toxicus, которые заселяют растение при заражении его нематодами (рис. 4 б) и выделяют нейротоксины, смертельно опасные для травоядных млекопитающих [19]. Трудно сказать, насколько выгодно такое заражение растению: с одной стороны, это мощная защита от полного выедания, с другой — учитывая вредоносность нематод-переносчиков в отношении семян и всходов, польза такой защиты для популяции в целом — большой вопрос. Рисунок 4. Схема жизненного цикла эндофитной бактерии Rathayibacter toxicus, переносимой фитопатогенными нематодами Anguina.а — Нематоды Anguina — носители эндофитных бактерий Rathayibacter toxicus — выходят из зараженных семян злаков на поверхность почвы и заражают молодые всходы. б — Развиваясь в зараженном растении, нематоды заселяют часть семян и формируют специальные образования — галлы, заполненные личинками ( nematode gall). В некоторых семенах личинки нематод вытесняются бактериями Rathayibacter toxicus, синтезирующими слизистый секрет и токсины ( bacterial gall). в — Животные, поедающие растения с семенами, зараженными бактериальными токсинами, заболевают и нередко гибнут. Recovery plan for Rathayibacter poisoning caused by Rathayibacter toxicus (syn. Clavibacter toxicus) Нематоды Anguina — не единственные "пособники" R. toxicus. Известно, что уровень синтеза коринетоксинов R. toxicus каким-то образом связан с присутствием бактериофага NCPPB3778 в клетках этих бактерий [20]. Несмотря на то, что гены биосинтеза коринетоксинов или какие-либо регуляторные гены не были обнаружены в геноме фага, зачастую оказывается, что только штаммы R. toxicus, зараженные фагом, могут синтезировать коринетоксины. Таким образом защита от фитофагов с помощью эндофитных микроорганизмов оказывается для растений довольно неоднозначным и в какой-то мере опасным предприятием, построенным на грани мутуалистических и антагонистических взаимоотношений. Тем не менее, по-видимому, абсолютное большинство растений, так или иначе, заселено эндофитами; и выгоды такого квартирантства для обоих партнеров закрепляются в эволюции. Причем локальные растительно-эндофитные взаимодействия зачастую оказывают глобальное влияние на целые популяции животных-фитофагов, в том числе человека.
Генеральный партнер конкурса — ежегодная биотехнологическая конференция BiotechClub, организованная международной инновационной биотехнологической компанией BIOCAD. 
Спонсор конкурса — компания SkyGen: передовой дистрибьютор продукции для life science на российском рынке. 
Спонсор конкурса — компания "Диаэм": крупнейший поставщик оборудования, реагентов и расходных материалов для биологических исследований и производств. 
"Книжный" спонсор конкурса — "Альпина нон-фикшн" В силу своей неспособности убегать или активно обороняться, растения вынуждены искать другие способы защиты от поедания растительноядными животными (фитофагами), например, синтез ядовитых для них веществ. Однако, по оценкам специалистов, только от 10 до 25% высших растений "умеют" синтезировать токсины [1]. В их число, кстати, не входят злаки — одни из самых лакомых и доступных для травоядных животных растений. При этом практически все злаки, да и большинство других растений, заселены эндофитными микроорганизмами — микроскопическими грибами или бактериями, обитающими внутри растения — в межклетниках, клеточных стенках, просветах сосудисто-волокнистых пучков; некоторые, особенно дрожжи и бактерии, обнаруживаются и прямо внутри клеток растений [2]. Они синтезировать токсины как раз умеют, и, по-видимому, именно для того, чтобы не дать съесть своего хозяина и не быть съеденным вместе с ним. Каких-либо повреждений тканей или иммунных реакций со стороны растения эндофитные грибы и бактерии, как правило, не вызывают. Напротив, они могут отплатить "за стол и дом" стимуляцией роста растения, повышением его устойчивости к засухе, морозам или засолению, а также противостоянием патогенным микроорганизмам и растительноядным животным [3]. Таким образом, взаимоотношения растений и эндофитных микроорганизмов вполне вписываются в рамки мутуализма — взаимовыгодного сожительства. Однако, как мы увидим далее, далеко не все так однозначно. Но все же, в любом случае, микроорганизмы — более искушенные биохимики, чем растения, и способны продуцировать более широкий спектр биологически активных веществ — ферментов, гормонов, регуляторов роста и в том числе токсичных веществ. Так почему бы не поручить синтез токсинов для защиты от фитофагов им? 
Рисунок 1. Схема вертикальной передачи мицелия эндофитного гриба Epichloë festucae от материнского растения к дочернему через завязь и семена. а — Сохранение мицелия эндофитного гриба в зараженном семени. б — Развитие мицелия в тканях прорастающих всходов. в и г — Распространение мицелия по вегетативным органам растения. д — Проникновение мицелия в ткани завязи без ее повреждения; мицелий сохраняется после оплодотворения в семени. Seed transmission of Epichloë endophytes in Lolium perenne is heavily influenced by host genetics
Рисунок 2. Мицелиальный "чехол" Epichloë на стебле Aranzadi
Рисунок 3а. Склероций спорыньи в колосе пшеницы Claviceps purpurea
Рисунок 3б. Прорастание плодовых тел из склероция "Топ-10 самых ядовитых грибов в мире"
Рисунок 4. Схема жизненного цикла эндофитной бактерии Rathayibacter toxicus, переносимой фитопатогенными нематодами Anguina. а — Нематоды Anguina — носители эндофитных бактерий Rathayibacter toxicus — выходят из зараженных семян злаков на поверхность почвы и заражают молодые всходы. б — Развиваясь в зараженном растении, нематоды заселяют часть семян и формируют специальные образования — галлы, заполненные личинками ( nematode gall). В некоторых семенах личинки нематод вытесняются бактериями Rathayibacter toxicus, синтезирующими слизистый секрет и токсины ( bacterial gall). в — Животные, поедающие растения с семенами, зараженными бактериальными токсинами, заболевают и нередко гибнут. Recovery plan for Rathayibacter poisoning caused by Rathayibacter toxicus (syn. Clavibacter toxicus)